‘钟山红’葡萄雄性不育形成机理研究

【摘要】‘钟山红’(‘魏可’自交后代)为南京农业大学选育的一个优良种质,雄蕊花丝短,且反卷,花粉无活力,自然授粉果穗大小粒果现象严重,出现大量无核果；花前套袋全为无核果实；判定其为葡萄雄性不育,2011年11月通过江苏省农作物品种审定委员会鉴定为葡萄新品种。葡萄雌能花品种是杂种优势利用的一种重要遗传工具和途径,且是生产优质无核商品葡萄的重要途径之一。明确葡萄雄性不育发生的机理,有重要的理论意义和应用价值。本研究以雌能花新品种‘钟山红’和其可育亲本‘魏可’为试验材料,采用酶联免疫技术对葡萄花蕾进行内源激素的测定。克隆了可能与花药发育及雄性不育相关的差异表达基因Vvms2和Vvmyb4,并对这两个基因进行了生物信息学分析、荧光定量分析及功能初步分析；构建了Vvmyb4的植物表达载体,并转化野生型烟草验证该基因的功能。主要研究结果如下：1.采用酶联免疫(ELISA)检测技术对花药发育不同时期(1.造孢期、2.花粉母细胞期、3.减数分裂期、4.四分体期、5.单核期、6.二核期、7.成熟花粉期)的花蕾组织中的吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GAs)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)含量进行测定。结果表明：‘钟山红’与‘魏可’花蕾中的IAA,GAS的含量在减数分裂期之前差异不显著,在四分体期及单核期‘钟山红’显著低于‘魏可’。‘钟山红’中的CTK含量在减数分裂期之前显著低于‘魏可’。‘魏可’在单核期ABA含量开始降低,而‘钟山红’在二核期才开始降低。‘钟山红’的IAA/ABA和GAs/ABA在二核期之前明显高于‘魏可’且比‘魏可’比值变化较大,因此认为IAA,GAS,CTK的亏缺,ABA的延后降低及IAA/ABA,GAs/ABA匕例失调与葡萄雄性不育有一定的关系。2.在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因MS2同源性最高的葡萄序列(CBI29968),设计特异引物进行克隆测序,通过生物信息学方法分析结构特征,利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在‘魏可’各组织中及‘魏可’和‘钟山红’雄蕊发育不同时期中的表达特性。结果表明：VvMS2基因cDNA编码区全长为1755bp,编码584个氨基酸,含有NAD结合域和雄性不育C-末端区域。VvMS2对应基因组DNA全长2776bp,含有9个外显子和8个内含子。基因编码蛋白质分子量为64.74kD,等电点为8.84。该基因与GenBank中其他来源的MS2蛋白序列的相似性为40%-71%。Vvms2为花蕾特异表达基因,且仅在花粉发育四分体期到二核期有表达,单核期‘魏可’的表达量显著高于同时期‘钟山红’。推测该基因异常表达与‘钟山红’葡萄雌能花形成有关。3.在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因VvMYB4同源性最高的葡萄序列,设计特异引物进行克隆测序,通过生物信息学方法分析结构特征,利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在‘魏可’和‘钟山红’雄蕊发育不同时期中的表达特性。VvMYB4基因cDNA编码区全长为978bp,编码325个氨基酸,含有R2R3两个保守的功能域。VvMYB4对应基因组DNA全长1174bp,含有3个外显子和2个内含子。基因编码蛋白质分子量为35.75kD,等电点为6.75。该基因与GenBank中其他来源的1VvMYB4蛋白序列的相似性为67%-87%。在花药发育的不同发育时期,VvMYB4在可育品种‘魏可’中表达量都很低,只有在二核期和成熟花粉期才检测到相对其他发育时期较高的VvMYB4的表达。但在不育品种‘钟山红’中,VvMYB4在四分体时期表达量突然升到了顶峰,随后到单核期迅速降低,到二核期和成熟花粉期表达量极低或基本不表达。推测该基因异常表达与‘钟山红’葡萄雌能花形成有关。4.构建了VvMYB4基因的植物表达载体,将构建好的载体转化农杆菌菌株EHA105感受态,采用叶盘法转化烟草叶片,获得抗性植株。抗性植株经GUS,PCR及RT-PCR检测筛选,最后得到2个株系的转基因烟草。对转基因烟草进行培养观察,结果显示转基因烟草与野生型烟草在营养生长阶段并无明显差异。到开花期,转基因植株雌蕊、花萼与野生型植株之间无明显差异。但转基因植株雄蕊、花药、花丝及花瓣颜色较野生型发生明显变化,表现为花药瘦小,花粉少,花丝缩短,花瓣颜色变浅。花粉萌发实验证明转基因烟草花粉萌发率很低或不萌发,扫描电镜说明转基因烟草1花粉外形改变,转基因烟草2花粉干瘪,无萌发沟,缺少细胞内含物。花前套袋,大多数自交不结实。但用野生型花粉授粉则可以正常结实,说明雌蕊发育正常,但VvMYB4基因降低了雄性育性。
【作者】郑焕；
【导师】陶建敏；
【作者基本信息】南京农业大学，果树学，2013，硕士
【关键词】葡萄雌能花；基因克隆；雄性不育；VvMS2；VvMYB4；

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